Human Airway Organoid Kit Plus

人氣管類器官培養(yǎng)基套裝Plus

1、 產(chǎn)品描述

?；锶藲夤茴惼鞴倥囵B(yǎng)試劑盒（Human Airway Organoid Kit Plus）是一種化學定義的細胞培養(yǎng)基，用于建立和維持從人氣管干細胞衍生的人氣管類器官。氣道上皮的自我更新由基底干細胞的增殖驅(qū)動。人氣管類器官包含基底細胞、纖毛細胞、分泌細胞和少量神經(jīng)內(nèi)分泌細胞，因此器官顯示出在體系結(jié)構(gòu)、細胞類型組成和自我更新動力學方面與氣道上皮的所有特征，因此對于氣道發(fā)育和疾病研究具有巨大的潛力。

2、 產(chǎn)品信息

3、 其他自備材料和試劑

4、 人氣管類器官培養(yǎng)基使用說明

1、   實收到類器官培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)基置于4℃冰箱進行解凍；

2、   待培養(yǎng)基解凍后上下顛倒充分混勻，在生物安全柜或潔凈工作臺中根據(jù)日常需求量進行分裝，推薦分裝成10mL/管；

3、   分裝后的培養(yǎng)基請密封后儲存于-20℃，使用時取出分裝的培養(yǎng)基放置室溫平衡后即可使用。

5、 人氣管類器官的建立與傳代培養(yǎng)

注意：涉及原代人體組織材料的研究必須遵守所有相關(guān)的機構(gòu)和政府法規(guī)。在收集主要人體組織材料之前，必須獲得所有受試者的知情同意。

a)      原代人氣管類器官的建立

1、   原代組織樣本應(yīng)在離體5min內(nèi)放入裝有預(yù)冷的活組織保存液（2-8℃）的樣本管中，樣本需要被活組織保存液覆蓋（如果樣品已經(jīng)放在其他緩沖液或培養(yǎng)基中，請用預(yù)冷的活組織保存液替換整個溶液）。低溫（2~8℃）運輸轉(zhuǎn)移至實驗室。

2、   實驗前先將基質(zhì)膠放置4℃冰上解凍，同時取出培養(yǎng)基放置室溫平衡。與細胞接觸的離心管、試管或者塑料吸頭需要用類器官培養(yǎng)防粘附潤洗液潤洗后使用。

3、   在潔凈工作臺中，將樣本轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，評估獲得的組織是否由上皮組成。如果存在脂肪或肌肉組織，請在解剖顯微鏡下使用刀或和鑷子盡可能多地去除這些非上皮成分。如果沒有脂肪或肌肉組織，請立即繼續(xù)下一步。

4、   用上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基或含雙抗的DPBS沖洗組織兩次。

5、   使用鑷子將組織轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，在冰上用無菌的將碎為0.5~2mm²大小。

6、   將剪碎的組織用50倍組織體積的重懸，并轉(zhuǎn)移至15mL離心管內(nèi)，吹打重懸組織塊。于37℃，100rpm條件下的恒溫搖床中，水平振蕩消化15-30分鐘，每隔10分鐘觀察組織消化情況，待組織塊明顯分散，懸液較渾濁時，取適量組織消化懸液鏡檢，待懸液中有較多活細胞團即可終止消化，若組織碎塊較大或消化不可適當延長消化時間。消化期間可以使用不同規(guī)格（順序從大到小如10mL、5mL、1mL）的移液管吹打組織消化懸液，幫助充分消化。當大多數(shù)組織片段能夠通過1mL移液器吸頭時，消化過程即完成。

7、   將FBS加入組織消化混合物中，最終濃度為2%，并使用100μm細胞過濾器過濾。

8、   收集濾液并在4℃下以250g離心3分鐘。在可見的紅色沉淀的情況下，吸棄上清液，加入2mL紅細胞裂解液重懸沉淀，在室溫下裂解紅細胞1分鐘，并在4℃下以250g離心3分鐘。

9、   吸棄上清液并將沉淀重懸于上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在4℃下以250g離心3分鐘，再次重復此步驟以去除消化液和FBS，在離心前可取適量的懸液進行細胞活性檢測。

10、 吸棄上清液，根據(jù)培養(yǎng)需求取適量細胞沉淀加入基質(zhì)膠（>70%）并在冰上混勻（注意：混勻吹打的動作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)），混勻后置于冰上。注：基質(zhì)膠應(yīng)保存在冰上以防止其凝固。盡快進行該過程。大約10,000個細胞應(yīng)接種在25μL基質(zhì)膠中。不要過度稀釋基質(zhì)膠（基質(zhì)膠比例應(yīng)>70%（基質(zhì)膠體積/總體積）），因為這可能會抑制固體液滴的正確形成。

11、 將基質(zhì)膠和細胞的混合懸液點入培養(yǎng)孔板底部正，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。

注意：一旦類器官重懸于基質(zhì)膠中，盡快進行種板，因為基質(zhì)膠可能會在試管或移液器吸頭中凝固。

12、 將培養(yǎng)板放入37℃和5%CO?的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)膠凝固。

13、 待基質(zhì)膠凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的類器官培養(yǎng)基，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。注：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因為這可能會破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

14、 將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。

15、 每隔2~3天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的室溫平衡的類器官培養(yǎng)基。

16、 密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，理想情況下，人氣道類器官應(yīng)在7-14天內(nèi)建成。

b)      人氣管類器官的傳代培養(yǎng)

1、   待類器官培養(yǎng)到直徑為100~500μm大小時（或變黑不再增大時），即可進行類器官的傳代（每代約1~2周）。以下操作與細胞接觸的耗材均需用潤洗液潤洗后使用：

2、   吸棄舊培養(yǎng)基，加入等體積上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用細胞刮刀或者移液管吸頭輕輕刮下（或吹打）基質(zhì)膠和類器官混合物，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中（每管最多收集2~3孔類器官，避免體積體積過大消化效率低），吹打5~10次，使類器官和基質(zhì)膠分離，300g離心3分鐘。

3、   去除上清液加入5倍于基質(zhì)膠和類器官混合物體積的類器官消化液，吹打混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中消化5~10分鐘。取出吹打混勻，取10μL混合液鏡檢是否消化成小的細胞團塊，消化不充分可適當延長消化時間。若要求細胞計數(shù)則需消化成單個細胞，可延長消化時間至10~20分鐘后終止消化后臺盼藍染色進行細胞計數(shù)。密切監(jiān)視消化過程使在類器官解離液中的孵育時間最短。

4、   消化完成后，加入5倍體積上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基吹打混勻以終止消化反應(yīng)，然后250g離心3分鐘。

5、   吸棄上清液，用上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗2次以去除殘留的消化液。次清洗可將類器官合并收集在同一個離心管中

6、   清洗完成后將離心沉淀中的細胞進行傳代培養(yǎng)，在細胞沉淀中加入基質(zhì)膠（>70%）并在冰上混勻（注意，混勻吹打的動作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)），混勻后置于冰上。注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

7、   將基質(zhì)膠和細胞的混合懸液點入培養(yǎng)孔板底部正，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

8、   將培養(yǎng)板放入37℃和5%CO?的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)膠凝固。

9、   待基質(zhì)膠凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的類器官培養(yǎng)基，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。注：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因為這可能會破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

10、 將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。

11、 每隔2~3天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的室溫平衡的類器官培養(yǎng)基。

12、 密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，直到類器官需要進行下一步實驗

V2.1版

更新時間：2025/5/27