Human Breast Organoid Kit Plus

人乳腺類(lèi)器官培養(yǎng)基套裝Plus

1、 產(chǎn)品描述

?；锶巳橄兕?lèi)器官培養(yǎng)基套裝Plus（Human Breast Organoid Kit Plus）是一種化學(xué)定義的細(xì)胞培養(yǎng)基，用于建立和維持人正常乳腺類(lèi)器官。乳腺類(lèi)器官能夠在體外增殖分化形成完整的乳腺導(dǎo)管和乳腺腺泡結(jié)構(gòu)，為研究正常乳腺干細(xì)胞及祖細(xì)胞、乳腺結(jié)構(gòu)的發(fā)育機(jī)制提供了良好的模型。

2、 產(chǎn)品信息

3、 其他自備材料和試劑

4、 人乳腺類(lèi)器官培養(yǎng)基使用說(shuō)明

1、   收到類(lèi)器官培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)基置于4℃冰箱進(jìn)行解凍；

2、   待培養(yǎng)基解凍后上下顛倒充分混勻，在生物安全柜或潔凈工作臺(tái)中根據(jù)日常需求量進(jìn)行分裝，推薦分裝成10mL/管；

3、   分裝后的培養(yǎng)基請(qǐng)密封后儲(chǔ)存于-20℃，使用時(shí)取出分裝的培養(yǎng)基放置室溫平衡后即可使用。

5、 人乳腺類(lèi)器官的建立和傳代培養(yǎng)

注意：涉及主要人體組織材料的研究必須遵循所有相關(guān)的機(jī)構(gòu)和政府法規(guī)。在收集主要人體組織材料之前，必須獲得所有受試者的知情同意。

a)     原代人乳腺類(lèi)器官的建立

1、   原代組織樣本應(yīng)在離體5min內(nèi)放入裝有預(yù)冷的活組織保存液（2-8℃）的樣本管中，樣本需要被活組織保存液覆蓋（如果樣品已經(jīng)放在其他緩沖液或培養(yǎng)基中，請(qǐng)用預(yù)冷的活組織保存液替換整個(gè)溶液）。低溫（2~8℃）運(yùn)輸轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。

2、   實(shí)驗(yàn)前先將基質(zhì)膠放置4℃冰上解凍，同時(shí)取出培養(yǎng)基放置室溫平衡。與細(xì)胞接觸的離心管、試管或者塑料吸頭需要用類(lèi)器官培養(yǎng)防粘附潤(rùn)洗液潤(rùn)洗后使用。

3、   在潔凈工作臺(tái)中，將樣本轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，評(píng)估獲得的組織是否由上皮組成。如果存在脂肪或肌肉組織，請(qǐng)?jiān)诮馄曙@微鏡下使用刀或和鑷子盡可能多地去除這些非上皮成分。如果沒(méi)有脂肪或肌肉組織，請(qǐng)立即繼續(xù)下一步。

4、   用上皮類(lèi)器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基或含雙抗的DPBS沖洗組織兩次。

5、   使用鑷子將組織轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，在冰上用無(wú)菌的將碎為0.5~2mm2大小。

6、   將剪碎的組織用50倍組織體積的重懸，并轉(zhuǎn)移至15mL離心管內(nèi)，吹打重懸組織塊。于37℃，100rpm條件下的恒溫?fù)u床中，水平振蕩消化15-30分鐘，每隔10分鐘觀察組織消化情況，待組織塊明顯分散，懸液較渾濁時(shí)，取適量組織消化懸液鏡檢，待懸液中有較多活細(xì)胞團(tuán)即可終止消化，若組織碎塊較大或消化不可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。消化期間可以使用不同規(guī)格（順序從大到小如10mL、5mL、1mL）的移液管吹打組織消化懸液，幫助充分消化。當(dāng)大多數(shù)組織片段能夠通過(guò)1mL移液器吸頭時(shí)，消化過(guò)程即完成。

7、   將FBS加入組織消化混合物中，最終濃度為2%，并使用100μm細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾。

8、   收集濾液并在4℃下以250g離心3分鐘。在可見(jiàn)的紅色沉淀的情況下，吸棄上清液，加入2mL紅細(xì)胞裂解液重懸沉淀，在室溫下裂解紅細(xì)胞1分鐘，并在4℃下以250g離心3分鐘。

9、   吸棄上清液并將沉淀重懸于上皮類(lèi)器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在4℃下以250g離心3分鐘，再次重復(fù)此步驟以去除消化液和FBS，在離心前可取適量的懸液進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。

10、 吸棄上清液，根據(jù)培養(yǎng)需求取適量細(xì)胞沉淀加入基質(zhì)膠（>70%）并在冰上混勻。

注意：混勻吹打的動(dòng)作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)，混勻后置于冰上。

注意：基質(zhì)膠應(yīng)保存在冰上以防止其凝固。盡快進(jìn)行該過(guò)程。大約10,000個(gè)細(xì)胞應(yīng)接種在25μL基質(zhì)膠中。不要過(guò)度稀釋基質(zhì)膠（基質(zhì)膠比例應(yīng)>70%（基質(zhì)膠體積/總體積）），因?yàn)檫@可能會(huì)抑制固體液滴的正確形成。

11、 將基質(zhì)膠和細(xì)胞的混合懸液點(diǎn)入培養(yǎng)孔板底部正，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。

注意：一旦類(lèi)器官重懸于基質(zhì)膠中，盡快進(jìn)行種板，因?yàn)榛|(zhì)膠可能會(huì)在試管或移液器吸頭中凝固。

12、 將培養(yǎng)板放入37℃和5%CO?的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)膠凝固。

13、 待基質(zhì)膠凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的類(lèi)器官培養(yǎng)基，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。注：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因?yàn)檫@可能會(huì)破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

14、 將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。

15、 每隔2~3天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的室溫平衡的類(lèi)器官培養(yǎng)基。

16、 密切監(jiān)測(cè)類(lèi)器官生長(zhǎng)狀態(tài)，理想情況下，人乳腺類(lèi)器官應(yīng)在7-14天內(nèi)建成。

b)      人乳腺類(lèi)器官的傳代培養(yǎng)

1、   待1.待類(lèi)器官培養(yǎng)到直徑為100~500μm大小時(shí)（或變黑不再增大時(shí)），即可進(jìn)行類(lèi)器官的傳代（每代約1~2周）。以下操作與細(xì)胞接觸的耗材均需用潤(rùn)洗液潤(rùn)洗后使用。

2、   吸棄舊培養(yǎng)基，加入等體積上皮類(lèi)器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮刀或者移液管吸頭輕輕刮下（或吹打）基質(zhì)膠和類(lèi)器官混合物，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中（每管最多收集2~3孔類(lèi)器官，避免體積體積過(guò)大消化效率低），吹打5~10次，使類(lèi)器官和基質(zhì)膠分離，300g離心3分鐘。

3、   去除上清液加入5倍于基質(zhì)膠和類(lèi)器官混合物體積的類(lèi)器官消化液，吹打混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中消化5~10分鐘。取出吹打混勻，取10μL混合液鏡檢是否消化成小的細(xì)胞團(tuán)塊，消化不充分可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。若要求細(xì)胞計(jì)數(shù)則需消化成單個(gè)細(xì)胞，可延長(zhǎng)消化時(shí)間至10~20分鐘后終止消化后臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。密切監(jiān)視消化過(guò)程使在類(lèi)器官解離液中的孵育時(shí)間最短。

4、   消化完成后，加入5倍體積上皮類(lèi)器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基吹打混勻以終止消化反應(yīng)，然后250g離心3分鐘。

5、   吸棄上清液，用上皮類(lèi)器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗2次以去除殘留的消化液。次清洗可將類(lèi)器官合并收集在同一個(gè)離心管中。

6、   清洗完成后將離心沉淀中的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在細(xì)胞沉淀中加入基質(zhì)膠（>70%）并在冰上混勻（注意，混勻吹打的動(dòng)作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)），混勻后置于冰上。注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在70%以上以保證培養(yǎng)過(guò)程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

7、   將基質(zhì)膠和細(xì)胞的混合懸液點(diǎn)入培養(yǎng)孔板底部正，使用槍頭稍微攤平懸液，注意避免懸液接觸孔板側(cè)壁。（推薦：96孔板接種3~10μL/孔，48孔板接種10~20μL/孔，24孔板接種20~30μL/孔）。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

8、   將培養(yǎng)板放入37℃和5%CO?的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)膠凝固。

9、   待基質(zhì)膠凝固后，沿壁緩慢加入室溫平衡的類(lèi)器官培養(yǎng)基，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。（推薦：96孔板加入100μL/孔，48孔板加入250μL/孔，24孔板加入500μL/孔）。

注意：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因?yàn)檫@可能會(huì)破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

10、 將培養(yǎng)板置于37℃和5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中。

11、 每隔2~3天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并加入新鮮的室溫平衡的類(lèi)器官培養(yǎng)基。

12、 密切監(jiān)測(cè)類(lèi)器官生長(zhǎng)狀態(tài)，直到類(lèi)器官需要進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

V2.1版

更新時(shí)間：2025/5/27