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StemGrowth series EBs 形成培養(yǎng)基

1、 產(chǎn)品描述

StemGrowth series EBs形成培養(yǎng)基是基于APEL2和TeSR的雙重優(yōu)化體系，其設(shè)計(jì)聚焦于多能干細(xì)胞（PSC）在懸浮培養(yǎng)中形成均一胚胎樣體（EBs）的生理需求。通過(guò)整合干細(xì)胞微環(huán)境調(diào)控與代謝適配原理，該體系在以下維度實(shí)現(xiàn)了高效EBs生成。本培養(yǎng)基將滲透壓精準(zhǔn)調(diào)控至270-290 mOsm/kg范圍，模擬胚胎發(fā)育早期的細(xì)胞外液環(huán)境，減少因滲透壓波動(dòng)引起的細(xì)胞膜張力異常。葡萄糖濃度優(yōu)化為4.5 g/L，平衡糖酵解（Warburg效應(yīng)）與線粒體氧化代謝，通過(guò)長(zhǎng)鏈IGF激活AMPK通路維持能量穩(wěn)態(tài)，同時(shí)抑制乳酸脫氫酶（LDH）活性，配合StemGrowth series 抗脅迫補(bǔ)充劑 1000x（ML-0827S10）可在48-72小時(shí)內(nèi)形成大小較為均一的EBs。

2、 產(chǎn)品信息

產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號(hào)	規(guī)格	存儲(chǔ)/運(yùn)輸	保質(zhì)期
StemGrowth series EBs 形成培養(yǎng)基	ML-0827S07	100mL	-20°C	24個(gè)月

3、 其他自備材料和試劑

4、 ?；锿扑]用細(xì)胞系

H1、H9、HN4、iPSCs帕金森患者來(lái)源DY043、iPSC-EGFP等

5、 新手須知

注意事項(xiàng)：在使用時(shí)應(yīng)始終穿戴，在處理諸如人體細(xì)胞或其他生物及有害物質(zhì)時(shí)應(yīng)遵循安全的實(shí)驗(yàn)室規(guī)程。

僅用于科學(xué)研究。

6、 使用說(shuō)明

a)      使用超低粘附96孔u底板48小時(shí)形成EBs

a.1、材料和試劑：

設(shè)備：DHS水平甩板機(jī)(041269)、生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱等

a.2、步驟

1、   基于多能干細(xì)胞培養(yǎng)SOP復(fù)蘇PSC，在六孔板中1:6傳代三次。

2、   第四代記P4，培養(yǎng)3-5天每天換液維持細(xì)胞狀態(tài)，使6孔板每孔細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%。

3、   檢測(cè)PSC無(wú)出現(xiàn)邊緣分化情況、細(xì)胞核大、細(xì)胞克隆島密集。室溫預(yù)熱30mLEBs形成培養(yǎng)基+60μL 抗脅迫補(bǔ)充劑 1000x ，6mL 水解酶溫和消化液、6mL DPBS。

4、   使用預(yù)熱的DPBS洗滌孔板中的細(xì)胞一次，吸棄DPBS。每孔加入1mL的水解酶溫和消化液，37度孵育8-12分鐘后，不要吸棄消化液，每孔加入1mL的EBs形成培養(yǎng)基含抗脅迫補(bǔ)充劑吹打孔板中的細(xì)胞兩次，收集于15mL離心管，150g/5min 離心收集細(xì)胞。

5、   離心結(jié)束后吸棄上清，加入1mLEBs 形成培養(yǎng)基含抗脅迫補(bǔ)充劑重懸細(xì)胞，加入臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)細(xì)胞、 檢測(cè)細(xì)胞活力。

6、   1mL 細(xì)胞懸液的細(xì)胞量一般大于2*10?個(gè)單細(xì)胞，活力大于80%再進(jìn)行下一步使用，如若活力不夠， 請(qǐng)排查原因，如臺(tái)盼藍(lán)質(zhì)量、孵育溫度等。

7、   將1mL的細(xì)胞懸液加入23mL的EBs 形成培養(yǎng)基含抗脅迫補(bǔ)充劑中，吹打10次，每孔100μL加入 超低粘附96孔u底板中，使用封口膜密封孔板，于水平甩板機(jī) 1500rpm/s 離心1min。

8、   取出孔板，裁開封口膜放入37度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，第二天加入100μL EBs 形成培養(yǎng)基不含抗脅迫補(bǔ)充劑，一般24小時(shí)后單細(xì)胞即可聚團(tuán)，48小時(shí)以上的EBs即可進(jìn)行下游分化實(shí)驗(yàn)。

b)     使用超低粘附6孔板和蜂窩板 72小時(shí)形成EBs

b.1、材料和試劑：

設(shè)備：DHS水平甩板機(jī)(041269)、生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱等

b.2、步驟

1、   基于多能干細(xì)胞培養(yǎng)SOP復(fù)蘇PSC，在六孔板中1:6傳代三次。

2、   第四代記P4，培養(yǎng)3-5天每天換液維持細(xì)胞狀態(tài)，使6孔板每孔細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%。

3、   檢測(cè)PSC無(wú)出現(xiàn)邊緣分化情況、細(xì)胞核大、細(xì)胞克隆島密集。室溫預(yù)熱30mLEBs形成培養(yǎng)基+60μL 抗脅迫補(bǔ)充劑 1000x ，6mL 水解酶溫和消化液、6mL DPBS。

4、   使用預(yù)熱的DPBS洗滌孔板中的細(xì)胞一次，吸棄DPBS。每孔加入1mL的水解酶溫和消化液，37度孵育8-12分鐘后，不要吸棄消化液，每孔加入1mL的EBs形成培養(yǎng)基含抗脅迫補(bǔ)充劑吹打孔板中的細(xì)胞兩次，收集于15mL離心管，150g/5min 離心收集細(xì)胞。

5、   離心結(jié)束后吸棄上清，加入1mLEBs 形成培養(yǎng)基含抗脅迫補(bǔ)充劑重懸細(xì)胞，加入臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)細(xì)胞、檢測(cè)細(xì)胞活力。

6、   1mL 細(xì)胞懸液的細(xì)胞量一般大于2*10?個(gè)單細(xì)胞，活力大于80%再進(jìn)行下一步使用，如若活力不夠， 請(qǐng)排查原因，如臺(tái)盼藍(lán)質(zhì)量、孵育溫度等。

7、   將1mL細(xì)胞懸浮液加入8mL的EBs 形成培養(yǎng)基含抗脅迫補(bǔ)充劑上下吹打10次重懸細(xì)胞，對(duì)于超低粘附6孔板直接形成EBs，每孔加入3mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)箱中靜置30min后，放入水平搖床110rpm/s 37度培養(yǎng)過(guò)夜。第二天每孔再補(bǔ)充2mL的EBs 形成培養(yǎng)基不含抗脅迫補(bǔ)充劑，第三天觀察EBs的直徑大于100μm即可進(jìn)行下游分化，某些細(xì)胞株系自然形成的EBs直徑可能過(guò)小，可以吸棄4mL孔板中的培養(yǎng)基(注意不要影響EBs)，加入2mL的EBs 形成培養(yǎng)基不含抗脅迫補(bǔ)充劑培養(yǎng)至72小時(shí)后進(jìn)行分化。

8、   對(duì)于蜂窩板形成EBs的方案，完成第6步前，準(zhǔn)備一把無(wú)菌的鑷子、一塊24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將蜂窩板用無(wú)菌鑷子夾入培養(yǎng)板的孔中(安裝于中心孔)，紫外滅菌30min。對(duì)上述重懸的9mL懸液，每孔600μL 的加入安裝了蜂窩板的孔板中，封口膜密封后，水平甩板機(jī)1500rpm/s離心5分鐘（記得使用 24 孔板配平）。離心結(jié)束后裁掉封口膜，37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，第二天加入600μL EBs形成培養(yǎng)基不含抗脅迫補(bǔ)充劑再培養(yǎng)24小時(shí)即可進(jìn)行下游分化實(shí)驗(yàn)。

圖1:不同細(xì)胞系基于96孔u底板48小時(shí)內(nèi)形成的EBs，上4x物鏡，下10x物鏡

圖2:測(cè)試了不同細(xì)胞系使用蜂窩板 48小時(shí)內(nèi)形成大小均一的EBs，均為4x物鏡

V2.1版

更新時(shí)間：2025/06/24