更新時(shí)間：2023-04-20 
瀏覽次數(shù)：894上一節(jié)我們聊到其他各種模型方案各自的缺陷，包括難以形成特定的生理結(jié)構(gòu)、無(wú)法發(fā)揮相對(duì)應(yīng)的功能、形成的信號(hào)通路與人體不一致等。因此類器官培養(yǎng)體系的一大重點(diǎn)便是了解目標(biāo)器官在體內(nèi)的結(jié)構(gòu)，盡可能完整的還原其在身體中的生長(zhǎng)環(huán)境以及信號(hào)通路。
本篇將以腸道類器官為例，為大家簡(jiǎn)要介紹腸道的結(jié)構(gòu)與功能。
腸道在功能和解剖學(xué)上分為小腸和大腸。小腸由十二指腸、空腸和回腸組成，而大腸由盲腸（包括闌尾）和結(jié)腸組成，結(jié)腸可進(jìn)一步分為升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸和乙狀結(jié)腸。
圖（A）（B）（C）小鼠腸道準(zhǔn)備流程
腸道最主要的作用是從攝入的食物中吸收營(yíng)養(yǎng)，其吸收功能主要由腸上皮吸收細(xì)胞膜刷狀緣中的特定營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)（Daniel and Zietek，2015)，其中一些轉(zhuǎn)運(yùn)體還可運(yùn)輸藥物（Daniel and Kottra，2004)，功能上，食物消化后營(yíng)養(yǎng)和礦物質(zhì)的攝取發(fā)生在小腸。因此，大多數(shù)營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)體在十二指腸及空腸中表達(dá)（Wuensch et al.2013; Yoshikawa et al.2011)。腸道相關(guān)淋巴組織（gut associated lymphoid tissueGALT）在回腸聚集形成所謂派爾集合淋巴結(jié)（Peryers patches)，體現(xiàn)了腸道作為免疫器官的重要作用，而大腸主要負(fù)責(zé)液體的吸收，且容納了絕大多數(shù)的腸道微生物。
幾乎整個(gè)胃腸道均起源于內(nèi)胚層。在胚胎發(fā)育期間，十二指腸的近端部分（直至膽管入口）由前腸形成，消化道的大部分（從膽管到橫結(jié)腸的近端）由中腸形成，橫結(jié)腸遠(yuǎn)端1/3、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸及直腸由后腸形成，位于胃腸道黏膜層的腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）調(diào)控腸道功能。
胃腸壁本身由4層組成：黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層（也稱外膜）。最外層也就是漿膜層或外膜，由結(jié)締組織組成，包裹肌層及肌間神經(jīng)叢；黏膜下層由包含有大血管、神經(jīng)管及神經(jīng)的結(jié)締組織組成，將黏膜連接至肌層，并支持其功能。黏膜層是胃腸道的最內(nèi)層，可進(jìn)一步被細(xì)分為黏膜肌層（一層薄薄的平滑?。?、固有層（一層包含免疫細(xì)胞的結(jié)締組織）和上皮層（覆蓋腸道單層上皮細(xì)胞，形成宿主及管腔之間的屏障），多數(shù)消化、吸收及分泌過(guò)程均通過(guò)腸上皮細(xì)胞進(jìn)行。
1）干細(xì)胞負(fù)責(zé)每4—5天不斷更新上皮細(xì)胞；
2）潘氏細(xì)胞為位于隱窩底部的干細(xì)胞龕提供因子，同時(shí)分泌抗菌肽；
3）分泌黏蛋白的杯狀細(xì)胞可形成覆蓋上皮的黏液，構(gòu)建物理屏障；
4）腸上皮吸收細(xì)胞可吸收營(yíng)養(yǎng)和離子；
5）EECs可分泌多種激素，控制腸道運(yùn)動(dòng)并調(diào)節(jié)代謝；
6）含有味覺(jué)化學(xué)感受器的tuft細(xì)胞可參與免疫調(diào)節(jié)（Barker，2014)。
需要注意的是，小腸上皮均有隱窩及絨毛，絨毛的長(zhǎng)度從十二指腸到回腸逐漸增加；而結(jié)腸上皮僅有隱窩，沒(méi)有絨毛。
小腸上皮細(xì)胞構(gòu)成示意圖
在正常生理?xiàng)l件下，結(jié)腸遠(yuǎn)端不存在潘氏細(xì)胞，剛才有提到潘氏細(xì)胞為位于隱窩底部的干細(xì)胞龕提供因子，同時(shí)分泌抗菌肽，這表明小腸和結(jié)腸的干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)存在差異。這是小腸類器官培養(yǎng)過(guò)程中不需要添加Wnt蛋白，但結(jié)腸類器官培養(yǎng)基需要添加Wnt蛋白的核心原因。
①建立器官發(fā)育與形態(tài)發(fā)生模型；
②建立疾病模型；
③再生醫(yī)學(xué)/精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究。
單個(gè)干細(xì)胞或分離的腸道隱窩均可培養(yǎng)形成腸道類器官（Sato et al., 2009)。
類器官的體外3D培養(yǎng)需要適當(dāng)?shù)募?xì)胞外支架來(lái)支持細(xì)胞黏附并作為膜蛋白的配體來(lái)觸發(fā)調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程的信號(hào)，包括存活、遷移、增殖、活性維持和分化成特定譜系。支架是工程化的聚合生物材料，其支持類似于體內(nèi)微環(huán)境的細(xì)胞組織，促進(jìn)細(xì)胞重組為功能性組織，在此期間細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)和酶，允許細(xì)胞通過(guò)周圍材料擴(kuò)散和遷移。
分布在各類細(xì)胞周圍的基底膜
3D類器官培養(yǎng)主要使用一種膠狀基質(zhì)（商業(yè)上稱為基質(zhì)膠），該基質(zhì)是從Engelbreth-Holm-Swarm肉瘤小鼠腫瘤衍生的細(xì)胞系中分離出來(lái)的基質(zhì)基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)得到的膠狀基質(zhì)（Liet al.1987)。
目前在全球廣泛使用的品牌是美國(guó)康寧公司的Matrigel，由于其壟斷地位及需求的暴增導(dǎo)致產(chǎn)品產(chǎn)能不足，近年中國(guó)廈門(mén)?；镆餐瞥鐾町a(chǎn)品：Matrigengel，在類器官培養(yǎng)中也被國(guó)內(nèi)外科學(xué)家廣泛使用。
?；锘|(zhì)膠
這種膠狀基質(zhì)在1987年第一次被開(kāi)發(fā)出來(lái)。1991年第一次被Aggeler用于乳腺上皮細(xì)胞的三維培養(yǎng)，其結(jié)構(gòu)類似于乳腺組織中的腺泡結(jié)構(gòu)（Aggeler et al., 1991)。基于此，基質(zhì)膠從此成為培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)方法中的重要成分。
2009年Hans團(tuán)隊(duì)首先利用基質(zhì)膠構(gòu)建了第一個(gè)類器官：上皮類器官，從此天然基質(zhì)膠被廣泛用于類器官培養(yǎng)。
為了成功建立類器官，必須仔細(xì)考慮不同的可用方案，除了所需的生物材料基質(zhì)外，還需要考慮添加細(xì)胞培養(yǎng)、增殖及分化所必需的生長(zhǎng)因子，從而保證類器官中的干細(xì)胞長(zhǎng)期生存的能力。這些生長(zhǎng)因子模擬生理組織自我更新或損傷修復(fù)過(guò)程中的干細(xì)胞巢環(huán)境，可以通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)物生長(zhǎng)條件來(lái)實(shí)現(xiàn)，如提供基底膜基質(zhì)（即Matrigengel）并添加一系列激動(dòng)劑（如Wnt和酪氨酸激酶受體）和抑制劑（如骨形態(tài)發(fā)生蛋白/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β）。這些生長(zhǎng)因子會(huì)因所用類器官干細(xì)胞的性質(zhì)而有所差異，研究人員仍在不斷改進(jìn)生長(zhǎng)因子的添加配方，以進(jìn)一步提高類器官體外存活率。
在類器官中加入必要的生長(zhǎng)因子，有助于干細(xì)胞在體外更好地增殖分化，從而形成類器官。例如，2009年Hans Clevers實(shí)驗(yàn)室將來(lái)自小鼠腸道的腸道成體干細(xì)胞接種于基質(zhì)膠中，并在培養(yǎng)基中添加R-spondin、Noggin、表皮生長(zhǎng)因子等干細(xì)胞必要生長(zhǎng)因子，才培養(yǎng)出了第一個(gè)具有隱窩樣結(jié)構(gòu)的小腸類器官。目前主要在類器官培養(yǎng)中使用的生長(zhǎng)因子包括：可支持干細(xì)胞增殖分化的生長(zhǎng)因子如Wnt-3A、R-spondin-1、Noggin等及小分子抑制劑等。
Wnt-3A是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活因子，可以促進(jìn)干細(xì)胞增殖分化，也在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。目前，Wnt-3A已被報(bào)道用于腦類器官及肝臟類器官培養(yǎng)基，除了Wnt-3A外，R-spondin-1是Lgr5的配體，而Lgr5陽(yáng)性的干細(xì)胞已被證實(shí)具有擴(kuò)增成為類器官的潛能。同時(shí)，R-spondin-1作為Wnt信號(hào)通路的激動(dòng)劑，可以通過(guò)增強(qiáng)Wnt信號(hào)在多方面發(fā)揮作用。因此，在乳腺類器官、小腸類器官、肝臟類器官等多個(gè)類器官的培養(yǎng)過(guò)程中均發(fā)揮重要作用，是類器官培養(yǎng)中最常見(jiàn)的生長(zhǎng)因子之一。
Wnt/β-catenin信號(hào)通路
骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4）是TGF－β超家族的一員，在細(xì)胞增殖分化中發(fā)揮重要作用可以抑制Wnt信號(hào)，從而控制干細(xì)胞的自我更新。BMP4被廣泛用于腸道類器官的研究，調(diào)節(jié)腸道內(nèi)分泌細(xì)胞的激素水平。Noggin也是TGF-β超家族的一員，可以與 BMP4、BMP7結(jié)合，是骨形態(tài)發(fā)生蛋白抑制劑的分泌蛋白，與骨形態(tài)發(fā)生蛋白起到相反的作用。Noggin與骨形態(tài)發(fā)生蛋白結(jié)合可以協(xié)調(diào) Wnt信號(hào)激活干細(xì)胞，促進(jìn)其增殖。因此，Noggin已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種類器官的長(zhǎng)期培養(yǎng)，如肝臟類器官、小腸類器官及輸卵管類器官。
表皮生長(zhǎng)因子（epidermalgrowth factor，EGF）主要促進(jìn)細(xì)胞的增殖，已被報(bào)道在輸卵管類器官及小腸類器官中發(fā)揮促進(jìn)類器官生長(zhǎng)發(fā)育的重要作用。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）可抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白，從而促進(jìn)類器官生長(zhǎng)。目前，F(xiàn)GF2、FGF7和FGF10是常用于類器官研究的家族成員，對(duì)類器官中多種干細(xì)胞的增殖分化具有重要的調(diào)控作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）不僅在類器官的血管生成及內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用，還可以促進(jìn)腎臟類器官的干細(xì)胞增殖，增強(qiáng)心臟類器官的心臟功能，促進(jìn)腦類器官的神經(jīng)分化等，因此被廣泛用于促進(jìn)類器官擴(kuò)增與微環(huán)境調(diào)控。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子不僅可以促進(jìn)肝臟類器官的形成，還可以維持胃類器官和小腸類器官的生長(zhǎng)。
VEGF信號(hào)通路
除了上述生長(zhǎng)因子，還有各種小分子抑制劑被添加至類器官培養(yǎng)基中，如CHIR99021、Y-27632、A83-01和SB431542，它們通過(guò)特異性地阻斷或激活各種信號(hào)通路，對(duì)干細(xì)胞的自我更新和增殖起到重要作用。目前已被添加于多個(gè)類器官培養(yǎng)基中，可以防止細(xì)胞凋亡并促進(jìn)類器官形成。
對(duì)于小鼠培養(yǎng)體系而言，成熟的腸道干細(xì)胞亞群多從Lgr5驅(qū)動(dòng)子后表達(dá)eGFP的小鼠中分離提??；而對(duì)于人源培養(yǎng)體系而言，胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells,ESCs）及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）均可用于腸道干細(xì)胞的分離培養(yǎng)（Spence et al., 2011)。根據(jù)所用的實(shí)驗(yàn)方法不同，培養(yǎng)物表現(xiàn)出的特性有輕微差異，干細(xì)胞來(lái)源的稱為“類器官"(organoids)，而隱窩來(lái)源的稱為“類腸道"(enteroids)( Wells and Spence, 2014 )。有研究者為鑒別不同的體外腸道培養(yǎng)物提出了新的命名法（Stelzner et al ., 2012 )，但目前多數(shù)文獻(xiàn)均使用“類器官"統(tǒng)稱這種新型的體外三維培養(yǎng)物。
相較于從隱窩中培養(yǎng)類器官，從單個(gè)干細(xì)胞培養(yǎng)類器官更復(fù)雜、更耗時(shí)、更昂貴，且需要特殊的實(shí)驗(yàn)器材。因此，單個(gè)干細(xì)胞進(jìn)行類器官培養(yǎng)一般僅用于干細(xì)胞生物學(xué)研究，而相對(duì)簡(jiǎn)單地用隱窩進(jìn)行類器官培養(yǎng)則廣泛應(yīng)用于其他類型研究。例如，野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠的腸隱窩可進(jìn)行類器官培養(yǎng)，并作為一種新型的“細(xì)胞系"廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究中。此外，從隱窩培養(yǎng)腸道類器官是研究營(yíng)養(yǎng)和藥物攝?。⊿ato and Clevers, 2013b）以及腸促胰島素激素分泌的最佳模型（Zietek et al .,2015 )。使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備在幾小時(shí)內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)以腸隱窩為基礎(chǔ)的類器官培養(yǎng)，商業(yè)化即用型培養(yǎng)基也使得類器官培養(yǎng)更加容易。
廈門(mén)?；镄∈笮∧c類器官培養(yǎng)基套裝是一款用于建立和維持小鼠腸道成體干細(xì)胞來(lái)源小腸類器官的wanquan培養(yǎng)基。生長(zhǎng)在該wanquan培養(yǎng)基中的小鼠小腸類器官主要由干細(xì)胞、腸祖細(xì)胞和腸絨毛細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和少量腸內(nèi)分泌細(xì)胞組成，在自我更新能力、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型和功能方面，小鼠小腸類器官重現(xiàn)了體內(nèi)小腸上皮的特征。
如何分離隱窩并培養(yǎng)腸道類器官
廈門(mén)?；锟萍加邢薰荆╔iamen Mogengel）位于中國(guó)·廈門(mén)國(guó)家高新技術(shù)創(chuàng)業(yè)中心。公司致力于3D細(xì)胞培養(yǎng)核心原材料的研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化升級(jí)。目前公司的產(chǎn)品有基質(zhì)膠、類器官培養(yǎng)基、細(xì)胞因子、3D細(xì)胞培養(yǎng)耗材、3D細(xì)胞培養(yǎng)智能顯微鏡等。公司擁有4大技術(shù)研發(fā)中心：分子克隆和細(xì)胞編輯中心、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心、蛋白表達(dá)和純化平臺(tái)、類器官質(zhì)檢系統(tǒng)和自動(dòng)化。
團(tuán)隊(duì)擁有十余年類器官技術(shù)研究基礎(chǔ)，實(shí)力雄厚，科研意志堅(jiān)定，學(xué)術(shù)態(tài)度嚴(yán)謹(jǐn)，大膽嘗試，勇于創(chuàng)新。公司推出的基質(zhì)膠、類器官培養(yǎng)試劑盒等產(chǎn)品廣泛適用于類器官培養(yǎng)、血管生成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲（transwell）實(shí)驗(yàn)、PDX、CDX模型實(shí)驗(yàn)、腫瘤球培養(yǎng)、腫瘤移植、皮下成瘤實(shí)驗(yàn)、干細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞分化研究以及其他待開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)類型。
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