人多能干細(xì)胞（hPSCs），包括人胚胎干細(xì)胞（ESCs）和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs），在藥物研發(fā)和疾病以及組織發(fā)育研究中的應(yīng)用逐漸增多。人多能干細(xì)胞（hPSCs）的一個(gè)重要特點(diǎn)是它們能夠分化成幾乎任何類型的細(xì)胞，包括心肌細(xì)胞。之前的研究表明，源自干細(xì)胞的心肌細(xì)胞具有與人原始心臟組織相似的特性和功能屬性。單層定向分化，結(jié)合小分子化合物和明確定義的培養(yǎng)基，已經(jīng)提高了以相對高純度（>80%）產(chǎn)生心肌細(xì)胞的效率，而無需額外的生長因子。然而，分化效率的變異和低重復(fù)性仍然存在問題，這些問題已被歸因于初始接種密度、細(xì)胞密度和分化過程中使用的化合物的批次變異等。此外，人胚胎干細(xì)胞（hESC）和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）系列中的內(nèi)部和間部克隆變異，如基因和蛋白質(zhì)表達(dá)、DNA甲基化和分化潛力的差異，對分化效率產(chǎn)生重大影響。

2020年10月28日挪威卑爾根大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系LaurenceA. Bindof團(tuán)隊(duì)在scientific reports上發(fā)表了文章A method for differentiating human induced pluripotent stem cells toward functional cardiomyocytes in 96?well microplates該研究在96孔板中使用明確定義的培養(yǎng)基和小分子化合物進(jìn)行心肌細(xì)胞分化。與較大的培養(yǎng)板相比，96孔板提供了更多的重復(fù)實(shí)驗(yàn)機(jī)會，從而增加了重復(fù)性的潛力，同時(shí)仍然具有經(jīng)濟(jì)高效的特點(diǎn)。

由于分化產(chǎn)量受到人胚胎干細(xì)胞（hESCs）/人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs）的質(zhì)量、基質(zhì)膠、培養(yǎng)基、小分子、細(xì)胞密度和細(xì)胞匯合度的影響，我們在96孔板中評估了這些因素。我們使用了兩種hESC系（H1和H9）和兩種hiPSC系：Detroit 551-A和AG05836B-151。為了考慮所采用的重編程方法可能存在的潛在差異，我們使用了一個(gè)通過逆轉(zhuǎn)錄病毒重編程的細(xì)胞系（Detroit 551-A）和一個(gè)無整合仙臺病毒重編程的細(xì)胞系（AG05836B-15）。此外，我們分別將傳代基質(zhì)膠和培養(yǎng)基更改為Geltrex和Essential 8 Medium（E8）。（圖1A）顯示了分化的時(shí)間線和所使用的培養(yǎng)基和小分子，以及心肌細(xì)胞發(fā)育標(biāo)志物和克隆形態(tài)（圖1B）。

圖1.心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化時(shí)間線

我們對細(xì)胞密度的研究表明，當(dāng)分化起始時(shí)的細(xì)胞密度分別為30-40％、60-70％和80-90％時(shí)，60-70％的細(xì)胞密度在分化第15天（D15）產(chǎn)生了功能性心肌細(xì)胞百分比最高的培養(yǎng)物（圖2）。然后，我們估算了在細(xì)胞接種后至少2天內(nèi)覆蓋60-70％孔板面積所需的細(xì)胞密度。接種包括將hPSC集落溶解成單細(xì)胞懸浮液和/或小團(tuán)塊，其中含有兩到六個(gè)細(xì)胞，使用E8培養(yǎng)基，并添加Y27632。在這種組合下，細(xì)胞在37°C下孵育過夜，24小時(shí)后將培養(yǎng)基更換為新鮮的E8培養(yǎng)基。因此，估算接種密度需要至少2天的培養(yǎng)時(shí)間，以為細(xì)胞恢復(fù)和達(dá)到所需的細(xì)胞密度提供足夠的時(shí)間。我們確定，對于hESCs和hiPSCs，2.4×104個(gè)細(xì)胞/cm2的密度對于在分化第7天和第9-10天的大面積心肌細(xì)胞的跳動(dòng)區(qū)域是最佳的。在這些實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞系在2-3天內(nèi)的細(xì)胞性為60-70％，然而，其他細(xì)胞系的最佳細(xì)胞性的時(shí)間可能會有所不同。此外，我們還注意到，如果不調(diào)整小分子CHIR99021的濃度，細(xì)胞性的任何偏差都會導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加或分化效率降低。我們發(fā)現(xiàn)，對于hESCs來說，8μM的濃度是最佳的，而對于hiPSCs，6μM的CHIR99021在D15時(shí)產(chǎn)生了高水平的TNNT2+細(xì)胞。

hESCs/hiPSCs在無線飼養(yǎng)條件下在Essential 8培養(yǎng)基（E8）中以每平方厘米2.4×104個(gè)細(xì)胞的密度傳代在Geltrex上。在3天內(nèi)，它們達(dá)到了60-70％的細(xì)胞性，這是通過以依賴于細(xì)胞濃度的方式應(yīng)用GSK3抑制劑CHIR99021誘導(dǎo)分化的理想時(shí)間點(diǎn)。WNT蛋白抑制劑-2（IWP2）在誘導(dǎo)分化后的72小時(shí)后添加，持續(xù)48小時(shí)。第5天提供新的培養(yǎng)基（不含胰島素的RPMI/B-27），從第7天開始，每隔兩天用新的RPMI/B-27（含胰島素）培養(yǎng)細(xì)胞（圖1）。我們觀察到在第7天出現(xiàn)了跳動(dòng)的心肌細(xì)胞區(qū)域，而在第9-10天，可以在孔板的大面積區(qū)域看到自發(fā)的收縮。自第10-15天收集了可收縮的心肌細(xì)胞以供進(jìn)一步分析。

圖2.細(xì)胞融合度對心肌細(xì)胞分化的影響

為了評估整個(gè)分化過程中的發(fā)育標(biāo)志。從hPSC向心臟譜系的分化涉及到原始褶皺樣群體的形成，從中發(fā)育出所有內(nèi)胚層和中胚層譜系，包括心血管祖細(xì)胞，如心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。為確保分化遵循正確的發(fā)育路線，我們在時(shí)間點(diǎn)上監(jiān)測了關(guān)鍵標(biāo)志物的表達(dá)水平，這些時(shí)間點(diǎn)對應(yīng)于特定階段的轉(zhuǎn)變，包括多能狀態(tài)（D0）、生殖層特異性（D3）、前體狀態(tài)（D5）和心肌細(xì)胞（D15）在ES系H1（圖3）。如預(yù)期，使用CHIR99021處理hPSC導(dǎo)致了多能性基因NANOG和POU5F1的表達(dá)下降，并且在分化的D3時(shí)出現(xiàn)早期中胚層標(biāo)志物，如MESP1、MIXL1和T的高水平（圖3，附圖S2和S3A）。H1和Detroit 551-A的進(jìn)一步分化是由D5上ISL1和TEMEM88表達(dá)的增加來定義的，而心肌細(xì)胞的分化則由特定標(biāo)志物（如TBX5、TNNT2、MYH6和MYL7）來定義（圖3，附圖S2和S3A）?；虮磉_(dá)層面顯示，當(dāng)細(xì)胞從生殖層特異性（D3）向心肌細(xì)胞（D15）發(fā)展時(shí)，GATA4和ATP2A2的表達(dá)逐漸增加，心臟特異性標(biāo)志物TNNT2和MYL7的表達(dá)與成熟和收縮活動(dòng)相吻合（圖3，附圖S2和S3A）。這些研究還顯示了MYL2（心室肌細(xì)胞的標(biāo)志物），從第12天開始存在（附圖S3A）。

為確保我們看到的是適當(dāng)?shù)某墒?，我們研究了成熟心肌?xì)胞標(biāo)志物（如HOPX和MYH7）在分化的較晚階段，即D30。我們表明HOPX和MYH7在分化的D30時(shí)增加，而MYH6下降（附圖S4）。

圖3.通過基因表達(dá)鑒定H1來源的心肌細(xì)胞

我們對hPSC進(jìn)行了多能性評估，并在分化開始之前的hPSC（第0天）中發(fā)現(xiàn)POU5F1的表達(dá)，但沒有TNNT2心肌細(xì)胞標(biāo)志物的證據(jù)。在分化過程的第7天，我們觀察到POU5F1的表達(dá)顯著減少，并出現(xiàn)了心肌細(xì)胞標(biāo)志物TNNT2（附圖S3B）。接下來，我們通過評估ISL1和NKX2-5的表達(dá)來評估心臟譜系的細(xì)胞，這些基因定義了心臟前體階段。我們發(fā)現(xiàn)在分化的第6天有ISL1和NKX2-5陽性細(xì)胞（圖4A），而在第10天可以強(qiáng)有力地檢測到TNNT2（圖4A）。使用MYL7抗體染色，這是心房肌細(xì)胞的特異標(biāo)志物，顯示了分化第10-12天內(nèi)的細(xì)胞中存在心肌肌節(jié)（圖4B-ii）。此外，我們在分化第10-12天內(nèi)的TNNT2+細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了Connexin 43（GJA1）的表達(dá)，這是縫隙連接標(biāo)志物（圖4B-iii）。MYL7和心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物肌鈣蛋白I3（TNNI3）的共染色（圖4B-iv）證實(shí)了在分化第10-12天的培養(yǎng)中存在已承諾的心肌細(xì)胞。

圖4.心肌細(xì)胞表征

在心臟譜系分化期間形成的主要細(xì)胞類型包括心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。在分化后期（第12-19天）對心肌細(xì)胞的標(biāo)志物（TNNT2和MYL7）進(jìn)行共染色顯示，H1培養(yǎng)的細(xì)胞中82±7%和60±10%呈陽性，而Detroit551-A培養(yǎng)的細(xì)胞中85.7±3%呈TNNT2陽性，79.7±3%呈MYL7陽性（圖5A）。根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果，H9的分化效率低，TNNT2陽性細(xì)胞為47±13%，MYL7陽性細(xì)胞為45%。然后，我們在第15天為心肌細(xì)胞染色，使用CDH5（內(nèi)皮譜系標(biāo)志物）和ACTA2（平滑?。?biāo)志物。這項(xiàng)分析確認(rèn)了平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞的存在，這些細(xì)胞在心臟譜系分化期間預(yù)計(jì)會成為副產(chǎn)物（圖5C）。

我們使用流式細(xì)胞術(shù)在第15天研究了心臟培養(yǎng)中內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞的相對比例。表面標(biāo)志物CD144和CD140b分別用于鑒定內(nèi)皮和平滑肌。同時(shí)，來自同一96孔板的樣本用心肌細(xì)胞標(biāo)志物TNNT2染色，以估計(jì)心肌細(xì)胞的數(shù)量（圖5B）。在H1來源的心肌細(xì)胞培養(yǎng)中，74.5±8%為TNNT2陽性細(xì)胞，9.5±2.94%染有平滑肌標(biāo)志物（CD140b），只有3.71±0.81%的細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)志物（CD144）（圖5B）。在Detroit 551-A培養(yǎng)中，TNNT2陽性細(xì)胞比例為77±0.18%，CD140b陽性細(xì)胞比例為18.45±0.1%，內(nèi)皮細(xì)胞比例為5.53±0.02%。在AG05836B-15培養(yǎng)中，67.2±0.2%為TNNT2陽性細(xì)胞，而21±0.1%和2±0.007%的細(xì)胞分別為CD140b和CD144標(biāo)志物陽性（圖5B）。

圖5.使用流式細(xì)胞術(shù)分析驗(yàn)證心肌細(xì)胞分化

為了研究孔間的異質(zhì)性，我們從多個(gè)孔中提取了RNA，并進(jìn)行了qPCR以評估相對于一個(gè)內(nèi)參基因GAPDH的TNNT2和NKX2-5的表達(dá)。我們隨機(jī)選擇了12分化孔，使用MagMAx分離試劑盒提取總RNA。我們觀察了H1的兩次分化試驗(yàn)，第一次分析了一個(gè)板的12個(gè)孔，而在第二次試驗(yàn)中，我們分析了3個(gè)不同板的多個(gè)孔。我們還從Detroit 551-A分化的心肌細(xì)胞分別提取了3個(gè)不同板上多個(gè)孔的RNA。這些數(shù)據(jù)在在線附表S1中顯示。變異性如圖6所示，我們計(jì)算了這些CT值之間的變異系數(shù)，變異系數(shù)在1.96%和7.30%之間變化，確認(rèn)了每個(gè)孔中的心肌細(xì)胞數(shù)量相似。

圖6. 96孔板中不同分化過程中的孔間異質(zhì)性研究

心臟功能，包括節(jié)奏性和收縮性，依賴于多種離子通道的表達(dá)，如鈉、鉀和鈣通道。為了測試分化的心肌細(xì)胞是否具有適當(dāng)?shù)碾娚硖匦?，我們采用了微電極陣列（MEA）并使用不同的心臟藥物對它們進(jìn)行挑戰(zhàn)。微電極陣列提供了一種高度敏感的、非侵入性的方法，用于研究電活性細(xì)胞的生理特性。MEA記錄了稱為細(xì)胞外場電位（FPs）的電波信號，這些信號是由心肌細(xì)胞的單層或小簇產(chǎn)生和塑造的。FP輪廓代表心臟動(dòng)作電位，并在某種程度上反映了心電圖記錄。通常情況下，人們會看到與Na+流入（R/Q峰）和膜去極化相對應(yīng)的迅速上升部分，一種被認(rèn)為對應(yīng)于Ca2+流入的慢波/臺段，以及與主要的K+流出（T峰）相對應(yīng)的復(fù)極化階段（圖7A）。

我們在分化的第11-13天將H1和Detroit551-A衍生的心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到MEA倉，并在接下來的14天內(nèi)（分化的第12-26天）監(jiān)測其穩(wěn)定性和心跳一致性特征。觀察期的選擇基于先前的研究，這些研究表明將心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到MEA倉以檢查它們的電生理活動(dòng)的最佳分化階段是第11-13天。

H1衍生的心肌細(xì)胞顯示了平均FP持續(xù)時(shí)間為298±20毫秒，心跳間隔（BI）為42±2次/分鐘，而Detroit551-A衍生的心肌細(xì)胞則顯示了平均FP持續(xù)時(shí)間為75±5毫秒，BI為49±4次/分鐘。隨著培養(yǎng)的時(shí)間延長，心跳間隔變得更加不規(guī)則，這如先前所述。為了測試hPSC衍生的心肌細(xì)胞的功能，我們應(yīng)用了以下藥物：β1和β2腎上腺素能受體激動(dòng)劑異丙腎上腺素（1 µM）、鉀通道拮抗劑E4031（1µM）、鈉通道拮抗劑（TTX，5 µM）、L-型鈣通道拮抗劑硝苯地平（5nM）以及5-羥色胺（血清素）受體-HT4激動(dòng)劑和HT3拮抗劑Mosapride（350nM）（圖7Biv）。盡管Detroit 551-A應(yīng)用的藥物較少，但這些細(xì)胞在應(yīng)用異丙腎上腺素和E4031后表現(xiàn)出相同的電生理模式改變。

正如預(yù)期的那樣，異丙腎上腺素增加了心跳頻率，并顯著減少了FP持續(xù)時(shí)間（FPD，圖7Bi，表1）。如預(yù)期，E4031降低了FP幅度（FPA，圖7Bii，表1），但與其他報(bào)告相反，我們觀察到FP持續(xù)時(shí)間（FPD）增加并輕微延長了心跳間隔5,24。應(yīng)用TTX導(dǎo)致了正峰幅度（pPA）顯著降低，增加了FPA，延長了BI，但對FPD沒有影響（圖7Biii）。硝苯地平的行為與描述一致，降低了pPA和FPD，但對BI沒有影響（圖7Biv）。Mosapride影響了FPA，并顯著降低了FPA/FPD比率，也稱為場電位幅度上升速度（FPUS），這是鈉和L型鈣通道功能的指標(biāo)。

圖7.hiPSC來源的心肌細(xì)胞的MEA記錄

總之，本研究改進(jìn)了將人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為功能性心肌細(xì)胞的方案，將其適應(yīng)到96孔板中。由此產(chǎn)生的心肌細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上表達(dá)心臟特異性標(biāo)志物，并具有電生理特性，證實(shí)了功能性心肌細(xì)胞的存在。

https://www.nature。。ｃｏｍ/articles/s41598-020-73656-2

?；锔杉?xì)胞金牌基質(zhì)膠是一種可溶性的基底膜基質(zhì)膠，這種基質(zhì)是通過基因編輯技術(shù)將多種表達(dá)膠原蛋白的基因序列插入到經(jīng)永生化處理的小鼠腫瘤細(xì)胞體系中，并在實(shí)體腫瘤中抽提出來的。它的主要成分是層粘連蛋白，接著是膠原蛋白IV、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和巢蛋白。基底膜基質(zhì)也含有轉(zhuǎn)化生長因子β、表皮生長因子、類胰島素生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子和在腫瘤中自然出現(xiàn)的其他生長因子。

干細(xì)胞金牌基質(zhì)膠信息表

類器官專用基礎(chǔ)培養(yǎng)基信息表

O27信息表